產品名稱：NEB E6300S cDNA第一鏈合成試劑盒 逆轉錄試劑盒

產品貨號：E6300

產品品牌：NEB (New England Biolabs)

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ProtoScript® cDNA 第一鏈合成試劑盒含兩種經優化的混合液：M-MuLV 酶混合液和 M-MuLV 反應混合液。M-MuLV 酶混合液含 M-MuLV 反轉錄酶和小鼠 RNase 抑制劑，M-MuLV 反應混合液含 dNTP 和經優化的緩沖液。該試劑盒還包含兩種優化的反轉錄引物和無核酸酶水。錨定的 Oligo-dT 引物 [d(T)23VN] 迫使引物與 polyA 尾的起始端退火。經優化的隨機引物混合液能隨機并持續性地與整個 RNA 模板配對，包括 mRNA 和無 polyA 尾的 RNA。合成的第一鏈 cDNA 產物長度可超過 10 kb

成功合成 cDNA 的要素：

RNA 模板
高純度的完整 RNA 對于靈敏的 RT-PCR 檢測至關重要。RNA 的 A260/A280 比值應至少 1.7 或更高。

總 RNA 或 mRNA 均可用于反轉錄反應。總 RNA 通常足以進行大多數 RT-PCR 分析。不過，如果需要，可以使用 PolyA Spin mRNA 分離試劑盒（NEB #S1560）或 mRNA 磁性分離試劑盒（NEB #S1550）獲得 mRNA。

檢測所需的 RNA 量取決于目標轉錄本的豐度。通常推薦使用 1 ng 至 1 μg 的總 RNA 或 0.1-100 ng 的 mRNA。

cDNA 第一鏈合成反應
RNA 和引物在 70℃ 條件下變性 5 分鐘，可以去除阻礙較長 cDNA 合成的二級結構。不過，可以在某些情況下省略此步驟（結果未發表）。

推薦在 42℃ 條件下溫育一小時，以獲得最高產量和最大長度。不過，許多靶標用較短的溫育時間即可進行檢測。例如，對于 2 kb cDNA 合成，溫育 5 分鐘就足夠了。

選擇反轉錄引物
Oligo d(T) 引物是大多數實驗的首·選，因為它確保所有 cDNA 拷貝在 mRNA 的 3′ 端終止并產生最長的連續 cDNA。錨定的 Oligo-dT 引物 [d(T)23VN] 迫使引物與 polyA 尾的起始端退火，從而防止在 polyA 尾的內部位點開始退火（1）。不過，如果需要，也可以選擇另外兩種引物。

隨機引物混合液是經優化的六聚體和 d(T)23VN 引物混合液。該混合液能隨機地與整個 RNA 模板配對，包括 mRNA 和無 polyA 尾的 RNA（例如核糖體 RNA）。隨機引物混合液產生的 cDNA 平均長度較短，可用于檢測多個短 RT-PCR 產物。隨機引物混合液在各種 RNA 模板中均具有良好的性能。

基因特異引物用于 cDNA 合成反應時，cDNA 產物只能用于擴增該轉錄本。RNA 起始量較低（低于 10 ng）且只需要一種特定的 cDNA 時，使用這種方法可以獲得良好的結果。

推薦的引物濃度：
引物：終濃度
OLIGO d(T)23VN：5 μM
隨機引物混合液：6 μM
特異引物：0.1–1 μM

產品名稱：NEB E6300S cDNA第一鏈合成試劑盒 逆轉錄試劑盒

產品貨號：E6300

產品品牌：NEB (New England Biolabs)

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